猪囊尾蚴病诊断技术

猪囊尾蚴病诊断技术　　1范围　　本标准规定了猪囊尾蚴病的病原分离与鉴定和酶联免疫吸附实验(ELISA)两种诊断技术　　本标准适用于猪囊尾蚴病的诊断和流行病学调查以及检疫。　　2病原分离与鉴定　　2.1病原分离　　2.1.1样品采集　　采集猪的咬肌、舌肌、内腰肌、膈肌、肋间肌、肩胛肌等，亦可采集脑、心脏、肝脏、肺脏　　2.1.2样品分离　　成熟的猪囊尾蚴为长椭圆形[(6毫米～10毫米)*5毫米]，半透明的囊壁内充满液体，上有一个黍粒大小的白色小结节即为头节(SCOLEX)和颈节(NECK)。脑内寄生的则为圆球形8毫米～10毫米。　　将上述任何部位的囊尾蚴，以手术刀和镊子剖离后，以生理盐水洗净，并用滤纸吸干。　　2.2病原鉴定　　2.2.1分离样品的鸦片制备　　以剪刀剪开囊壁，取出完整的头节，再以滤纸吸干囊液后，将其置于两张载玻片之间并压片，于两张载玻片间加入1～2滴生理盐水后置于显微镜下镜检。　　2.2.2镜检　　以低倍(物镜8倍、目镜5倍)观察囊尾蚴头节的完整性。　　2.2.3结果判定　　低倍镜检，可见到头节的顶部有顶突，顶突上有内外两圈排列整齐的小钩，顶突的稍下方有四个均等的圆盘状吸盘，即判为猪囊尾蚴。　　3酶联免疫吸附试验(ELISA)　　3.1材料准备　　3.1.1器材　　ELISA反应板、酶联免疫检测仪、加样板、洗瓶、10厘米*1厘米普通滤纸条等。　　3.1.2试剂　　猪囊尾蚴层析抗原、葡萄球菌A蛋白(SPA)辣根过氧化物酶(HRP)标记物(HRP―SPA)、猪囊尾蚴标准阴性和阳性全血滤纸片等。　　3.1.3被检猪全血血片　　将10厘米*1厘米普通滤纸条的一段标记被检猪号码，另一端吸取被检猪任何部位血液1―2滴，于室内阴干后，置于4度冰箱内(可保存6个月)。　　3.1.4溶液配制　　溶液配置的方法见附录A(标准的附录)。　　3.2操作方法　　3.2.1.1首先以抗原包被液(见附录A中A1)洗涤ELISA反应板各三次。　　3.2.1.2以抗原包被液将抗原使用说明书稀释至工作浓度。　　3.2.1.3用加样器加工作浓度抗原至ELISA反应板各孔内，每孔0.1毫升，加盖后置于室温(11～29)过夜。　　注：包被过夜的WLISA反应板加盖后置于冰箱冷冻室内(可保存6各月)，或将包被过夜的ELISA反应板按3.2.2方法洗涤后，晾干，装入塑料袋内密封，置于4冰箱内。(可保存4个月)。　　3.2.2洗涤　　用力甩净包被过夜的ELISA反应板孔内的抗原包被液，每孔加入洗涤液(见附录A中A2)，浸泡3分钟后，用力甩去洗涤液，并用滤纸吸去残留的洗涤液和驱除孔内气泡，重新加入洗涤液，按同样方法共洗涤三次，即3*3分钟冲洗.。　　3.2.3血片的处理　　将被检血片、标准阴性血片及标准阳性血片均剪成1厘米*1厘米大小，分别置于青霉素瓶内，每1厘米*1厘米血片加入稀释液(见附录A中A2)0.3毫升，浸泡20分钟，即血片变白后即可。　　3.2.4加样　　3.2.4.1每份被检血片浸液加两孔，每孔0.1毫升。　　3.2.4.2标准阴性、标准阳性对照孔内相应血片浸液两孔，每孔0.1毫升。　　3.2.4.3空白对照孔加稀释液两孔，每孔0.1毫升。　　3.2.4.4加样后加盖，于室温(11～29)放置30分钟。　　3.2.5洗涤方法同3.2.2。　　3.2.6加酶标记SPA。　　3.2.6.1HRP―SPA标准物按使用说明书以稀释液稀释至工作浓度。　　3.2.6.2被检孔、标准阴性孔每孔加HRP―SPA标记物0.1毫升。　　3.2.6.3空白对照孔亦加0.1毫升。　　3.2.6.4加完后加盖，于室温(11～29)放置30分钟。　　3.2.7洗涤方法同3.2.2　　3.2.8加底物　　每孔加现配置的底物溶液(见附录A中A3)0.1毫升，于室温(11～29)放置10个月。　　3.3判定　　在对照孔成立的前提下，即在标准阳性孔呈深黄色，标准阴性孔呈无色或浅黄色，空白孔呈无色，判定检验结果。　　3.3.1目测判定　　与标准阴性孔相比，颜色深于标准阴性孔者，即判定为ELISA法阳性病猪(+)。　　3.3.2酶联免疫检测仪判定(490纳米)　　以空白对照孔调零，测定被检孔透光(OD)值。当OD<0.22，判定为ELISA法阴性(―)；当OD>0.26判定为ELISA法阳性(+)；当0.23