雏鸭病毒性肝炎的诊断法

鸭病毒性肝炎(Duckvirushepatitis,DVH)简称鸭肝炎,是主要发生于3周龄以下雏鸭的一种传播迅速、高度致死性的传染病。1950年,LevinePP和FabricantJ在美国首先报道了Ⅰ型鸭病毒性肝炎的发生。1954年,Asplin报道鸭病毒性肝炎在英国暴发流行。随后,加拿大、西德、意大利、印度、法国、匈牙利、日本等国均有报道。1963年首次报道在我国的上海地区某些鸭场也发生鸭病毒性肝炎DHV-Ⅰ型。而DHV-Ⅱ型和DHV-Ⅲ型病毒分别于1965年发现于英国诺福克和1969年发现于美国长岛,DHV-Ⅱ型至今尚无其他国家的报道。　　但近年来，国内外学者相继报道了DHV-Ⅰ型的变异情况,Barnhardt株是在美国一个农场分离到的一个明显的血清学变异株,与DHV-Ⅰ型在中和试验中呈部分交叉反应。在福州地区发现不能被标准DHV-Ⅰ型疫苗保护的鸭肝炎。苏敬良等从疑似鸭肝炎的病死鸭体内分离到1株与Ⅰ型、Ⅲ型鸭肝炎病毒无血清学交叉免疫反应的小RNA病毒,暂时将其病毒称为新型鸭肝炎病毒。　　　　在该病的诊断上,依据其发病日龄、临床症状和病理变化可做出初步诊断，但确诊和病毒定型必须依赖进一步的病原学和血清学诊断。目前，应用于DHV的血清学诊断主要有中和试验、酶联免疫吸附试验、琼脂免疫扩散试验、间接血凝试验和免疫荧光等,下面就近年来的诊断方法做简要概述。　　1临床诊断　　该病主要发生于3周龄以下的雏鸭,潜伏期短,常突然发病,感染雏鸭首先表现为跟不上群,此后短时间内就停止运动,蹲伏并半闭眼。病鸭身体侧卧、两腿痉挛后踢,头向后背,呈角弓反张样。雏鸭在出现症状后1h左右就发生死亡。　　剖检特征性病变主要在肝脏,常表现为肝脏肿大、质脆,外观淡红、土黄或斑驳状,表面有弥漫性出血点或出血斑；胆囊肿胀呈长卵圆形充满胆汁,胆汁常呈褐色或淡茶色；脾脏和肾脏也多有不同程度的肿胀,表面有出血点或呈斑驳状；心肌常呈淡灰色,质软有淤血,似开水煮样；此外,部分病例还可见喉、气管、支气管等有轻度卡他性炎症及脑充血、出血等现象[5]。根据该病的发病情况、临床症状和病理变化可作出初步诊断。　　2实验室诊断　　2.1病毒的分离和初步鉴定　　病毒初代分离一般使用鸭胚,在鸭胚中连续传几代后,很容易在鸭胚中增殖,Levine和Fabricant（1950）首次用鸭胚分离DHV获得成功。因目前国内尚无SPF鸭场,而鸭胚中又往往含有DHV母源抗体,妨碍病毒增殖,故试验研究以及制作疫苗时接种和传代常用SPF鸡胚,病毒感染后主要表现为胚胎蜷缩,发育不良,全身水肿,体表充血且头颈、背部等常有散在的针尖大小的出血点。肝脏为土黄、灰绿或鲜红色,肿大、质脆,出血点明显,边缘坏死或在表面有灰绿色或黄白色坏死区,呈花斑状,此外,有的鸡胚尿囊液和卵黄囊还常呈绿色。胚体变化有一定的诊断意义。　　获得高纯度的病毒抗原可以对病毒进行电镜直接观察,并开展免疫学监测、诊断以及分子生物学研究。Taylor(1967)试图以硫酸铵沉淀、超速离心方法对细胞增殖的DHV进行纯化,但未能最终达到目的。以后很多学者尝试着先离心初提,然后经氯仿抽提,PEG反透析浓缩蔗糖密度梯度离心等方法进行提纯,以得到较为纯净的病毒,也未能如愿。杨奎以抗DHVIgG偶联活化的Sepharose4B制成亲和层析柱,提纯感染致死的雏鸭肝脏匀浆中的病毒,电镜下背景干净,杂蛋白少,病毒大小约为40nm,但病毒的特性未进一步验证。孙刚等在电镜下可见到直径为32nm～49nm的病毒粒子,颗粒结构清晰,大小和结构均符合Ⅰ型ＤＨＶ的特征。　　DHV由于病毒颗粒较小,得到较为纯化的病毒一直困扰着研究者,很多学者通过各种提纯的方法进行尝试,但至今尚未见到一张确切的纯化病毒的电镜照片。　　2.2中和试验　　由于至今尚未明确DHV的基因序列,因此该病的实验室诊断主要依靠血清学中和试验加以诊断。LevinePR等（1950）首先将中和试验(Virus-neutralizationtest,VN)应用于DHV诊断鉴定,以后逐渐为各国学者所引用。通常在鸡胚上以固定血清-稀释病毒法进行,也有人在鸭胚、雏鸭或病毒适应细胞中进行试验。Hwang记述了一种准确、可重复的Ⅰ型鸭肝炎病毒鸡胚中和试验。WoolcockPR等[9]首先报道了用中和抗体进行的空斑减少试验,认为要比鸡胚中和试验敏感得多。Chalmers和Woolcock检测了从16个非感染鸭收集的血清,其半数空斑减少滴度(VN)在1∶12到1∶250之间,平均1∶59。他们建议阴性对照血清的最大空斑减少滴度应设为1∶250。KaletaEF[10]用北京鸭肾细胞培养的DHV进行了微量中和试验,既快速又易于判定终点。陈琨等成功地在鸭胚单层肝细胞上进行了DHV-Ⅰ型的微量血清中和试验,发现DHV形成CPE的能力可以被特异性血清中和,可以用于病毒鉴定、疫病诊断和免疫检测。　　到目前为止,VN仍是诊断鸭病毒性肝炎的最可靠的方法,该方法被认为是既特异又敏感,是公认的方法。缺点为烦琐、费时，不能快速诊断,不适于基层应用。