欧鳗嗜水气单胞菌病的研究

近年来，欧鳗的大规模集约化养殖已在我国日益增多。但是，随着养殖规模的扩大，养殖密度的不断提高，各种影响欧鳗成活率的问题也日渐增多，而由嗜水气单胞菌作为病原的欧鳗暴发性传染病则是其中一个突出问题。本文对嗜水气单胞菌的生理生化特性、致病因子、致病条件等作了一系列的初步研究，旨在为欧鳗暴发性传染病的防治提供有力的理论依据，更好地推动欧鳗养殖业向着更强、更快、更健康的方向发展。一、材料与方法1.病原菌的分离采用普通蛋白琼脂培养基，其成份为胰蛋白胨10g，酵母膏10g，氯化钠5g，琼脂18～20g，pH7.2～7.4，15磅20分钟灭菌备用。取患典型病症的鳗鱼，以无菌解剖刀将溃烂表层切开，以接种环迅速挑取少许病灶深层粘液，进行琼脂平板划线分离。28℃，24小时常规培养后，出现一些形态基本一致的菌落。挑取单菌落，进行纯培养，然后转接斜面备用。2.致病性实验将实验菌种接斜面，28℃培养约24小时，每个斜面中加入无菌生理盐水5～10mL，制成浓厚菌悬液。取1mL菌悬液，以活菌平板计数法测定细菌数，吸取0.1mL菌悬液，注入健康鳗鲡腹腔中（注射前已置水族箱中观察5天），同时设对照，置24～28℃水族箱中观察其症状。3.病原菌的形态观察和生理生化实验采用致病力较强的菌株Ah3、Ah26、Ah38在28℃条件下，经24小时培养，进行革兰氏染色，鞭毛染色，观察其形态及其它生理生化实验。4.血清型研究1）采用小白兔（从市场上购买）制备抗血清。攻毒用健康鳗鱼（由养鳗场提供），规格为40～50g左右，试验前观察5～7天证实健康无病。2）将具有强致病力的Ah3、Ah26、Ah38等菌株分别于营养琼脂上培养24小时，刮取菌苔，用无菌生理盐水冲洗菌体三次，将菌体分别用0.35%福尔马林灭活25小时，制得全菌抗原（WC抗原），4℃冰箱保存备用；3）以0.35%福尔马林灭活体0.1mL（浓度为1×10E9cell/mL）加等量弗氏完全佐剂混合均匀，皮下多点免疫白兔，以后每隔一周耳静脉加强免疫，并逐次加大抗原剂量，获满意效价后颈动脉放血取血清。4）试管凝聚法：免抗血清（1∶60）稀释0.25mL，加入0.25mL浓度为15R/mL抗原，充分摇匀，4℃，12小时，观察其凝聚反应。5.嗜水气单胞菌毒力（LD50）测定Ah菌株接种营养肉汤，28℃培养24小时，测菌浓度，用无菌生理盐水10倍系列稀释菌体，腹腔注射健康鳗鲡，实验水温25℃，记录死鱼数及注射菌量，按Reed－Muench法计算LD50。6.溶血活力测定将Ah菌株纯分离物接种于10%兔血平板，28℃培养过夜，以溶血圈直径与菌落之比示溶血活力。7.致病条件的探索性测定采用致病力较强的Ah38号菌株为攻毒菌株，调整水族箱内水体环境，使其含菌量大约为5～104cells/mL，在不同条件下，使健康鳗鲡浸浴其中，以观察嗜水气单胞菌的条件致病性。二、实验结果1.本实验共分离出菌株63株，其中经人工感染具有致病力的菌株有8株，在这8株菌中，又有3株菌的致病力是极强的。2.病原菌的形态观察及生理生化特性。本实验结果表明，我们从病鱼中就分离到的Ah3、Ah6、Ah7、An26、Ah31、Ah38、Ah51、Ah53等菌株的形态、培养特性及生理生化反应基本一致，现以Ah38号菌株为代表简述如下：在营养琼脂平板上，28℃，18～24小时培养菌落圆形、湿润、表面光滑、低凸，边缘整齐，半透明，乳白色，直径1～1.5mm左右，有异味。在肉汤培养基中，28℃，18～24小时培养液均匀混浊，表面呈雾状薄膜，一摇即散，在高倍显微镜下，呈两端圆形的直杆菌，单个或成对，能运动，无芽胞，无荚膜，革兰氏染色阴性，电镜观察有单生鞭毛。根据这些培养特性，我们确认所分离到的菌株属于嗜水气单胞菌（Aeromonushydrophila），它们是引发欧洲鳗暴发性传染病的主要病原，这一点已得到了大多数学者的一致公认。3.我们以致病力实验中致病能力较强的Ah3、Ah26、Ah38号菌株制备兔抗血清，并与其它5株Ah菌株进行了试管凝聚试验，结果表明，Ah3与Ah38属同一血清型，Ah26属另一血清型，其余5株分属这两个血清型，反应专一性强，没有发现能同时与两种血清型反应的菌株。4.嗜水气单胞菌毒力（LD50）测定实验结果向我们表明，八株Ah菌株对健康鳗鲡均有强的毒力，最强的Ah38号菌株，其LD50低于104CFU，同时，毒力强的菌株其菌溶血圈直径与菌落直径之比大于2，表明它有较强的溶血活力，其它LD50较低的菌株其溶血活力也较低。这个实验结果启示我们，嗜水气单胞菌的毒力与其溶血活力有着一定的线性关系，不同血清型的菌株其溶血能力不一致，在我们的实验中，以Ah38号菌株所代表的血清型有着更强的致病力，这为我们今后寻找防治嗜水气单胞菌感染有效的用生物技术提供了一个新的思路。5.嗜水气单胞菌的条件致病性实验结果表明，当水体中含有一定量的嗜水气单胞菌时，假如鱼体健康水质状况良好，那么鱼感染疾病的几率是很小的；但当鱼体本身受到一定的损害时，比如说，腮丝破损或表皮破损，尤其是鳃丝受到损害时，鱼则很容易受细菌感染而发病；而当鱼体受伤，水体环境亦差时，鱼体的死亡速度和死亡率最高是不言自明的，正如我们的实验所表示的那样。三、讨论嗜水气单胞菌作为水中的固有菌群，由于它具有宿主范围广、感染力强等特点，而成为淡水鱼类养殖业病害的主要病原之一。在实验中所分离到的具有强致病力的Ah3、Ah26；Ah38号菌株分别代表着两种不同的血清型，他们组成了引发江浙沪一带淡水鱼暴发性传染病的主要病原；同时，毒力实验和溶血活力实验也表明，毒力强的菌株也有着较强的溶血活力。这似乎是嗜水气单胞杆菌引起鱼类大面积溃疡出血的原因，这个结果与某些文献报道结果基本一致。这些学者还认为嗜水气单胞菌能引起鱼体出血、溶血和死亡，其产生和溶血素、肉毒素和细胞毒素可能是致病因子有关。本实验也表明，不同的菌株其毒性强弱是不同的。我们推测有的菌株只有一种毒性因子，有的则有多种，这与一些学者的某些观点是一致的。关于嗜水气单胞菌的侵染途径，我们初步推测是以腮为主要途径，侵染后以肝脏为主要增殖部位，继而再向全身弥漫性扩展，在本次实验中，我们的致病菌株主要都由肝中分离得到，再感染后也以肝脏中出现病菌时间最早，说明嗜水气单胞菌感染时还有一定的亲嗜性。氨氮亚硝酸盐并不能为嗜水气单胞菌的生长提供营养，但含量过高却是导致鱼类发病的重要环境因子。原因在于亚硝酸盐氮能破坏机体血液的血红蛋白，使红血球失去携氧能力，而氨氮除直接引起鱼类中毒以外，还不断分解产生亚硝酸盐氮，从而使鱼的抗病机能降低，容易受细菌的侵染而生病。在我们的实验中，氨氮、亚硝酸盐氮值仅为正常值的两倍，鳗鱼的死亡率即明显高于对照组，也说明了这点。因此，我们初步认为，嗜水气单胞菌作为引发淡水鱼类暴发性传染病的主要病原，属于条件致病菌，它的传染性与鱼体的健康状况和水体环境有关。近年来，大量涌现的文献都报道，嗜水气单胞菌的耐药范围和强度均在不断拓广和加强，且药的残留已对人类尤其是儿童的身体健康构成了严重威胁。在实践工作中，我们就应把重点转向控制养鱼环境这个环节上来，保护水质，减少细菌的侵染途径，才是防治鱼病的根本。